绿色荧光蛋白能够通过自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，通过基因工程与其它蛋白融合，它可以让不可见的蛋白质成为可见，因此在过去的二十多年里成为生物学家和医学科学家研究细胞内各类生物化学过程的指路星，可以说是生物学研究的重要工具。对其的原创性发现和后来的重要发展斩获了年诺贝尔化学奖，投身其中的诸位科学家的探索之旅则堪称科学史上的一段传奇佳话。
撰文
徐亦迅
生命科学史的发展脉络是从容易观测的宏观层面（比如物种分类和大体解剖学）进入需要仪器才能观测的微观层面（比如显微解剖学研究的组织和细胞）。十七世纪荷兰科学家列文虎克(AntonievanLeeuwenhoek)用他改进的光学显微镜首先观察并描述了单细胞生物，就是生物学历史上的一个分水岭。在显微镜的帮助下，生物学家们逐渐观察到了以前都不知其存在的细菌、细胞、细胞器等微观研究对象。这样的还原论研究一旦达到分子水平，就连电子显微镜也很难让我们直接观测蛋白质等生物大分子在活体细胞中的表达和定位。从维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria，下文简称发光水母或水母)中分离的绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein,GFP），让曾经不可见的蛋白质成为可见，在过去的二十多年里成为生物学家和医学科学家研究细胞内各类生物化学过程的指路星。本文要讲述的就是几位科学家的故事，他们为GFP引发的生物学革命做出了重要贡献。
生物发光现象的早期研究
GFP发现的缘起与生物发光现象（bioluminescence）密不可分，因此我们首先要介绍一下不同类型的低温发光（luminescence）。
图1：各种类型的低温发光现象及其激发模式
火是人类历史上最重要的发明，与它相联的白炽发光（incandescence）通常定义为物体被加热到高温时发出的可见光。低温发光则是一种由不与环境处于热平衡的激发态化学组分自发放射的可见光。两千五百多年前的古希腊科学家亚里士多德，就在《论颜色》一书中写道：“有些不是火而且与火的产生无关的物体似乎可以自然发光”。这意味着人类很早就意识到白炽发光和低温发光的重要区别：白炽灯泡在照明时效率不高，只能把一小部分电能转化为光能，而其余能量以热的形式被耗散；而生物发光则是一种高效的化学反应，在将化学能转化为光能的过程中几乎不产生热，因此也称为“冷光”。
按照不同的激发模式，我们可以把低温发光分为光致发光(photoluminescence)、电致发光(electroluminescence)、化学发光(chemiluminescence，生物发光是一种特殊的化学发光)等很多种类(图1)。最为常见的光致发光是荧光(fluorescence)和磷光(phosphorescence)，请读者们特别注意荧光与生物发光的区别。
自然界中最为常见的一种生物发光现象就是萤火虫。每到夏日的夜晚，萤火虫在草丛里点点飞舞，构筑成奇幻的美景。唐代大诗人李白曾作《咏萤火》一诗：“雨打灯难灭，风吹色更明。若飞天上去，定作月边星”。
图2：生物发光的研究肇始于科学家们对萤火虫现象的着迷
除了萤火虫，自然界还有很多物种有低温发光的能力，其中包括细菌、原生动物、真菌、水母、乌贼等。科学家们很早就对生物发光现象有深入研究的好奇之心，但一直缺乏有效的科研手段。直到年，英国化学家波义耳(RobertBoyle)用气泵将钟罩内的空气抽去，发现里面的真菌不再发光。当他再将空气导入时，真菌的生物发光能力恢复。在十七世纪的化学界，人们对空气的成分还一无所知。只有等到年代，瑞典化学家舍勒(CarlWilhelmScheele)和英国化学家普利斯特里(JosephPriestley)独立发现了最终由法国化学家拉瓦锡(AntoineLavoisier)阐明的氧气，生物发光对氧气的依赖性终于浮出水面。
又经历了一个多世纪的徘徊不前，生物发光的化学机理探索由法国生理学教授杜勃瓦(RaphaelDubois)带来新的转折点。在年的一个实验中，杜勃瓦先用冷水将叩头虫(Pyrophorus)的发光组织在试管里匀浆，发现抽提物在短暂发光后变暗。他用沸水取得的组织抽提物则完全不发光，令他惊讶的是，当冷却的热水抽提物被加入已经停止发光的冷水抽提物时，混合物居然再度发光(图3)。若想让冷水抽提物持续发光，杜勃瓦就需要不断补加冷却的热水抽提物。
图3：杜勃瓦年首先发现“萤光素-萤光素酶”生物发光原理的著名实验[Pieribone,V.Gruber,D.F.()AglowintheDark:TheRevolutionaryScienceofBiofluorescence,BelknapHarvard.]
杜勃瓦随后在其它包括萤火虫在内的发光生物中得到了相似的实验结果，于是他得出了两个重要结论：(1)生物发光的反应除了氧气之外，至少还需要两个化学组分；(2)发光反应中的“燃料”组分可以耐受沸水的高温，而“点燃剂”或催化剂不耐热。杜勃瓦决定借用来自罗马神话的拉丁词Lucifer(字面意思是“光之使者”)来命名这两个组分：不耐热的催化剂名为萤光素酶(luciferase)，而耐热的小分子则名为萤光素(法语：luciferine，英语：luciferin)。
很多生物学家的后续研究表明：对于很多发光物种而言，萤光素酶有不同的蛋白序列，而萤光素也呈现多样化的有机小分子结构，但“萤光素-萤光素酶”的生物发光原理都是成立的。生物发光研究者的目标也就可以具体化，选择一个感兴趣的发光物种，用生物化学手段来分离纯化不同的萤光素和萤光素酶。通过对萤火虫发光系统的深入研究，科学家们很快又发现在氧气、萤光素、萤光素酶之外，ATP和Mg2+离子也是必要条件(图3)。
生物发光对于陆生物种而言并不常见，而在深海里却有超过90%的海洋生物能够发光。从海平面每往下75米，阳光的强度就要减弱10倍。在阳光无法到达的深度以下，会发光的动物在寻找食物、逃避敌害和吸引配偶上拥有明显的优势。在大致阐明萤火虫的发光机理之后，很多科学家就把目光转向海洋发光生物，其中最有名的就是美国普林斯顿大学开宗立派的哈维教授(E.NewtonHarvey)。
年，时年28岁的哈维携夫人前往日本蜜月旅行。三崎临海实验所附近的海域适合两人在夜间游泳，哈维在畅游之余迷上了一种叫做希氏弯喉海萤(Vargulahilgendorfii,曾用属名Cypridina)的发光海洋生物。海萤在采集和抽干后可以长期保存，用水濡湿后又能发光，因此被哈维视为用生物化学手段研究生物发光的最佳实验材料。哈维实验室发现海萤的发光系统比萤火虫要简单，只需萤光素、萤光素酶、氧气，而无需ATP和Mg2+离子(图4)。但哈维团队在部分纯化了海萤的萤光素之后，努力钻研了二十多年也无法获得其结晶。而没有高纯度的萤光素，他们就无法通过确定其分子结构来深入研究海萤发光的化学机理。
图4：希氏弯喉海萤的萤光素-萤光素酶生物发光系统
下村修结晶纯化海萤的萤光素
海萤的萤光素难以被完全纯化，为GFP故事的第一位主角下村修(OsamuShimomura)登上历史舞台提供了契机。下村修“人生的起跑线”和同样出生于年的沃森(JamesWatson)相比，简直就是后者的“阴性对照”(negativecontrol)，充满了崎岖与坎坷。由于父亲是军人，下村修主要由居住在长崎县谏早市的祖母抚养长大。年4月，刚升入谏早中学初一的下村修，和他的同学们都要遵照日本政府在当年3月修订的《国家总动员法》参加军训。年秋季升入初三后，学校又开始经常性取消课程，要求学生们去大村市的一家军用飞机修理厂义务劳动。美军很快盯上了这家军工厂，出动了二十多架B-29轰炸机将其彻底摧毁，下村修有好几位跑得不够快的同学不幸遇难。
正所谓“福无双至，祸不单行”。年8月9日早上10点57分，长崎市又不幸迎来了美军的第二颗原子弹。当时下村修和几位同学正在长崎市中心15公里外的另一家军工厂里工作，熟悉的空袭警报刚拉响时，他们还处变不惊地走出厂房爬上附近一个小山丘观望。下村修看到一架B-29轰炸机飞往南边市中心方向，空投下三个载物降落伞。事后才知道，这是在他们没看到的原子弹投放与最后爆炸的间隔期内，“大艺术家”号飞机投放的三个无线电高空测候器。此时大家还误以为这次轰炸可能威胁不大，于是决定回到厂房试图继续工作。刚一坐下，窗外袭来的强烈闪光就让同学们暂时失明半分钟，随后是一声巨响和气压的骤变……军工厂和长崎之间的距离显然是下村修和小伙伴们能够劫后余生的关键。
第二次世界大战虽然随着日本投降而宣告结束，年仅17岁的下村修依然看不到任何未来的曙光。谏早中学很多师生在原子弹爆炸时罹难，所有的学生档案都被炸毁，因此近几届的初中生都不能正常毕业。下村修连续两年报考高中(日语：高等学校)或技术高校(日语：高等工业学校)，都因没法提供初中成绩而失利。直到年4月，长崎医学院的师生由于在原子弹爆炸时伤亡惨重，重建的迫切需要才使下村修被他并不感兴趣的药学院录取(图5)，这也是他当时接受高等教育的唯一机会。
图5：年长崎药学院的临时校园
刚刚在一片废墟上重建的长崎医学院教学资源极度匮乏，原先的20名教授中有12位在原子弹爆炸时遇难，4位受了重伤。药学院课程的教学任务大都只能由经验不足的讲师们来担当。由于教学经费的限制，下村修在三年本科期间以分析化学和物理化学方面的训练为主，只有少数机会学习有机化学知识或进行有机合成实验。下村修的分析化学课老师安永峻五(ShungoYasunaga)很快发现这位学生出众的动手能力，特别准许他把一些试剂带回家去钻研利用毛细管色谱的分离纯化。这项研究最终让下村修在年与安永教授联名用日语发表了他学术生涯的第一篇论文。
年3月，下村修以总成绩全班第一从长崎药学院毕业，并向武田药品公司递交了入职申请，但一位面试官坦率地指出他的个性不适合在公司环境里发展。安永教授对下村修及时伸以援手，邀请他留校担任分析化学课助教。下村修对自己将来的人生并没有刻意规划，只要有一份工作就专心去做，也从未想过报考研究生院以获得更高的学位。安永教授在下村修工作四年之后，为他争取到了一个带薪去其他院校学术访问一年的机会。
作为下村修职业生涯里的第一位贵人，安永教授还主动帮助他寻找合适的访学实验室。安永在日本化学界的人脉主要在名古屋大学，他认为专攻生物化学的江上不二夫教授(FujioEgami)是开阔下村修科研视野的最佳人选。日本的电话通讯系统在战后多年也未能全面恢复，安永教授只能亲自带着下村修，从长崎坐十几个小时的火车来到名古屋，没想到江上教授那几天外出参加学术会议而未得一见。偶然事件改变历史发展轨迹的例子比比皆是，如果当天下村修见到了江上教授而顺利进入他的实验室，那么读者朋友们此刻恐怕就不会读到这个有趣的故事。两人转而去拜访有机化学家平田义正教授(YoshimasaHirata)，简短谈话几分钟后，平田教授就欢迎下村修随时到他实验室来做访问学生。
年4月，平田教授指着一个真空干燥器对刚来实验室报到的下村修说：“这里面有大量已被抽干的希氏弯喉海萤，这种海洋动物通过萤光素和萤光素酶的相互作用而发光。海萤的萤光素很不稳定，一遇到氧气就会降解。你是否愿意尝试一下这个萤光素的纯化和结晶？”下村修深知这个高难度的课题不适合平田教授的研究生们，而身为访问学生的他没有攻读学位的负担，决心以一种“初生牛犊”的放松心态大胆尝试。早在年，哈维实验室的安德森(RubertAnderson)发明了两步抽提法，可以将这个很不稳定的萤光素部分纯化倍左右，并通过吸收光谱推测出其分子结构中有氨基酸的组分。下村修在此基础上推算，想要得到结晶纯度的萤光素至少需要克抽干海萤作为起始原料，这是哈维实验室用量的10倍，也就需要他搭建一个巨大的索氏提取器(图6左)。
图6：下村修在年经过十个月的艰苦努力完成海萤的萤光素纯化与结晶(黑白照片无法显示晶体实际的深红色)
下村修在艰辛的科研探索过程中发现，用氮气或者惰性气体都不足以消除抽提系统中痕量氧气对萤光素的消耗。他必须往系统中通入氢气，这样痕量氧气就会被转化为液态水而被硫酸吸收。化学工作者无人不知对氢气操作不当就会引发爆炸事故，因此平田实验室其他成员在下村修紧张实验时都会与他保持相当的距离。氢气的使用虽然为下村修带来了突破性进展，但用各种方法试图结晶总是失败。每次尝试结晶前的抽提物制备，都需要他在极少睡眠的状态下连续工作一周，失败后的抽提物在报废前只能做一些简单的组分分析。不离不弃的下村修平均每个月要这样辛苦一周，直到年2月的一个晚上，看来又要面临一次失败。他在回家前决定在将要报废的抽提物中加入等体积的浓盐酸，等黄色的溶液变为暗红色后放在实验台上过夜，准备第二天再尝试检测其中有哪几个氨基酸。
下村修早上回到实验室却发现溶液由暗红色变为无色，第一感以为是盐酸导致萤光素水解后的结果。随后他在试管底部发现了少量黑色沉淀物，通过显微镜细看，居然是红色的针状晶体(图6右)！这些晶体通过与海萤的萤光素酶提取液混合后可以发光，正式宣告萤光素结晶取得成功。事后回看，浓盐酸促成萤光素的结晶在其结构未知时只能来自意外发现，并且当晚平田实验室的煤气炉关闭，溶液在室温持续下降时过夜对结晶过程的帮助也不容忽视。
“苦心人，天不负”，下村修十个月的科研拼搏取得了出乎意料的突破，他在名古屋大学的学术访问也被平田教授延期一年，确保其第一篇英语学术论文在年顺利发表。哈维教授的衣钵传人约翰逊(FrankJohnson)此时已是美国普林斯顿大学的正教授，他在读到这篇论文后不由惊叹一个困扰了哈维学派二十多年的难题，居然被一位只有本科学历的年轻日本学者解决！这次难得的成功为下村修带来了职业生涯的一个重要机遇：年春天，他回到长崎药学院不久就收到约翰逊教授的邀请信，定于下一年秋季前往普林斯顿大学担任为期三年的访问学者。
下村修与发光水母和星期五港的不解之缘
下村修于年9月抵达普林斯顿大学。约翰逊教授告诉他，本实验室现在最感兴趣的研究对象是发光水母，希望他借着研究海萤发光的成功势头，在水母发光的机理研究上取得突破(图7)。想要获得足够的实验材料，当时全美只有华盛顿州圣胡安群岛(SanJuanIslands)上的星期五港(FridayHarbor)海域，每年夏天会有大量的水母可以捕捞。
图7改编自：Chalfie,M.()NobelLecture.
从年开始，约翰逊几乎每年夏天都要与研究组骨干成员自带仪器，从普林斯顿长途开车七天来到星期五港采集水母。为了用生化手段研究水母发光，他们先要手工切割大量打捞上来的水母伞膜(图8)，利用当地华盛顿大学分校的实验室条件，把伞膜边缘发光器官的挤出液(squeezates)冷冻保存。
图8：分布在北美洲西岸的维多利亚多管发光水母及其伞膜边缘的生物发光器官。来源：