#重组蛋白#
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前言
大分子药物中蛋白类药物由于作用靶点明确、特异性强的优势，成为近年来药物研发的热点，当前国内外已有多款蛋白类药物获批上市，包括抗体、细胞因子、多肽等。当然，蛋白类药物也存在一些缺陷，主要表现为在溶剂中结构不稳定、易形成聚体或变性失活，无法达到疗效和安全性指标。为解决这一问题，药品生产企业常采用冷冻干燥技术制备冻干制剂，不仅可维持蛋白质的稳定性，还能延长有效期限，降低储存和运输成本，对蛋白类药物的疗效保障和成本降低至关重要。
由于其物理特性，冻干制剂的质量分析也不同于水针剂，需在检测前对冻干粉进行复溶（也称重悬）。作为蛋白冻干粉检测的关键处理步骤，复溶的处理方式直接影响蛋白产品的质量分析结果，尤其是蛋白的纯度和聚体形式。这篇文章中菌菌将以重组蛋白冻干粉为例，分享复溶方法对蛋白聚体产生的影响。
首先了解下目标重组蛋白的理化性质：
预测为疏水性蛋白，目标产物为单体形式。
选择蛋白冻干粉的复溶方法：
使用不同体积的1%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液重悬冻干粉，使冻干粉终浓度分别为1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml，移液枪吹打使粉末完全重悬。
蛋白纯度的检测方法：
由于冻干工艺可能会导致蛋白聚体的产生，因此冻干样品中可能存在的杂质包括蛋白质寡聚体或多聚体。已知目的蛋白为单体形式，为避免还原反应造成的结果偏差，选择非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白纯度，上样缓冲液不包含还原剂β-巯基乙醇，以保留蛋白的寡聚形式。具体操作方法参考中国药典三部通则聚丙烯酰胺凝胶电泳法，使用考马斯亮蓝法进行染色，该方法可用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制及定量测定。
非还原型SDS-PAGE结果：
根据中国药典要求，加样孔中样品的蛋白含量不低于10g以上（考马斯亮蓝染色法），将实际蛋白上样量定为10μg。
凝胶显色、脱色完毕后，使用凝胶扫描系统进行拍照，观察蛋白条带分布。如图1所示，泳道1为Marker；泳道2样品浓度为1mg/ml，在二聚体和单体大小处观察到明显的蛋白条带，且单体为主要的蛋白形式；泳道3样品浓度为5mg/ml，分别在二聚体和单体大小处有明显的蛋白条带，二聚体处条带较泳道2明显；泳道4样品浓度为10mg/ml，除二聚体和单体大小处的蛋白条带外，在约三聚体大小处也明显观察到蛋白条带。
图1:蛋白纯度和杂质检测（非还原型SDS-PAGE）
星耀小TIP：
考虑到样品中可能存在寡聚体杂质，因此采用非还原型SDS-PAGE，保留了蛋白质的寡聚形式，真实地反映样品质量。与还原型SDS与蛋白质结合方式不同，非还原型SDS-PAGE中蛋白的泳动速率可能不成比例，分子量大小稍有偏移，因此非还原型SDS-PAGE主要用于纯度和杂质的测定。
Image软件定量分析结果：
使用Image软件进行定量和纯度分析，结果显示，泳道2、3、4中单体（即目的蛋白）的占比分别为95.6%、84.3%和75.4%，如下表所示。该结果显示，随着冻干粉复溶样品浓度的增加，单体的占比随之减少，相应地二聚体和（或）三聚体的占比增加。即不同的复溶方法导致检测结果的不一致性，主要体现在单体与寡聚体的占比发生改变。
表1：蛋白纯度检测（非还原型SDS-PAGE）
结果讨论：
从实验结果得知，使用1%SDS溶液复溶蛋白冻干粉，随着复溶样品中蛋白浓度的增加，蛋白寡聚体的占比随之升高，而目的产物单体的占比相应减少。推测原因是，根据序列特性，预测目的蛋白为疏水性蛋白，目的蛋白中的疏水基团在极性溶液中易发生聚集从而形成蛋白聚体。随着复溶样品中蛋白浓度的升高，蛋白分子间距离拉近，疏水作用力增强，进一步促进了聚体的形成。更多关于蛋白质聚集的机制、影响因素、检测和控制方法可戳链接查看：蛋白质聚体的形成机制、检测与控制方法
由此可见，复溶条件对冻干粉的检测结果有着显著影响，冻干样品质量分析方法开发的过程中，应基于蛋白的理化性质，如稳定性、亲水/疏水特性，对复溶溶剂（包括pH、离子强度、有机溶剂、添加剂等影响因素）、样品稀释浓度等条件进行摸索，以建立适用性强、稳健可靠的分析平台。
结语
在生物药工艺开发和商业化生产的所有阶段，随着生物药的种类和制剂不断丰富，用于支持对生物制品进行质量控制的分析方法的复杂性不断增加，分析方法的不适用性很可能会对结果判断造成误导，成为药物开发的瓶颈，延缓后续研究的开展。开发合适的分析方法可用来分析和表征生物制品，为关键的工艺开发、制剂开发、质量控制及稳定性研究奠定基础。
参考文献：
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