余甘子PhyllanthusemblicaL.是大戟科叶下珠属热带、亚热带落叶小乔木，其果实是中药余甘子，俗名滇橄榄、油甘子、山油甘、庵摩勒等，常见于中国南部、印度和部分非洲国家[1]。余甘子风味独特、营养丰富、药用价值与保健功能显著，在利咽、降糖、调节血脂代谢、预防牙龈炎等方面作用突出[2-3]，含有丰富的维生素C，被称为“维C之王”，此外，可水解鞣质是余甘子中的主要酚类物质[4]。在中国西北部少数民族聚集区喜食牛羊肉，常将余甘子泡茶饮用，用以消渴解腻；泰国，印度僧侣在日常生活中也经常含服余甘子，用于生津止渴[5]。目前，余甘子在全球17个国家的传统医学系统中使用，特别是中国藏医学和印度阿育吠陀医学[6]，被联合国卫生组织指定为全世界推广种植的3种保健植物之一[7]。
“析霜”是指某些药材长期暴露在空气中时可在其表面析出化学成分晶状物质的一种特殊现象[8]。从历史源流来看，五味子的“霜”发现最早，首载于南北朝时期的《雷公炮炙论》[9]。柿霜在宋代被《本草图经》中记载为“白柿”，柿饼以表面挂白霜者品质佳，具有清热生津止渴的功效[10]。《药材学》记载不同产地的牡丹皮中，以铜陵凤凰山所产的凤丹皮所具亮星最多，质量亦最佳[11]，可见对某些药材而言，“析霜”后其品质更优。余甘子富含有多酚类成分，其药材在贮藏过程中也会发生类似析霜现象，药材在干燥阴凉处存放2～3年后表面会析出一层白霜（图1）。药材流通从业者认为，析霜后的余甘子药材品质更优，有“析霜者佳”的说法。部分有经验的药工会依据余甘子表面析霜的程度来判断余甘子的品质，但尚未发现相关研究报道。目前，对于余甘子药材表面的白霜构成并不明确，其“析霜”现象与药材品质的关联尚无科学依据。
针对上述问题，本研究主要采用扫描电镜（SEM）及能谱仪（EDS）观察余甘子表面白霜的微观结构及元素组成，采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对余甘子表面白霜结构官能团进行鉴别，采用UPLC-Q-TOF-MS对霜中主要化学成分进行定性鉴别，采用电子舌（E-tongue）及志愿者口尝法对析霜后余甘子味道及生津作用评价，采用质谱成像技术对余甘子中化合物的含量和空间分布信息进行研究，分析其“析霜”的代谢物可能变化规律。旨在揭示余甘子表面白霜的化学成分，探讨白霜形成与余甘子品质的内在关联，进一步解释余甘子传统认知“析霜者佳”的科学内涵，为余甘子品质评价提供参考。
1材料
FEIInsepectF50型扫描电镜（美国赛默飞公司），EDAXOctaneSuper能谱仪（美国依达克斯有限公司），Vanquish型超高效液相色谱联用Q-Exactive型四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国赛默飞公司），SAB系列智能味觉分析系统（日本INSENT公司），傅里叶变换红外光谱仪（赛默飞Nicolet），SYNAPTXS高分辨率飞行时间质谱仪（美国Waters公司）。BSAS型万分之一分析天平和BT25S型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司），Milli-Q型超纯水仪（美国Millipore公司），冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
余甘子药材经成都中医药大学药学院许润春副教授鉴定为大戟科植物余甘子P.emblicaL.的干燥成熟果实，样品信息见表1。柠檬酸、粘酸、DL-(＋)-苹果酸、没食子酸对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB、CHB、CHB、CHB，质量分数≥98%），鞣花酸和柯里拉京对照品（四川维克奇生物科技有限公司，批号wkq、whq，质量分数≥98%），水为超纯水，甲醇、甲酸为色谱级，溴化钾，其他试剂均为分析纯。
2方法
2.1白霜的收集
选取各批次中表面析霜的余甘子药材，用硬毛刷小心刷下药材表面白霜，并按照各批次编号。
2.2SEM-EDS检测
取干燥余甘子表面白霜用导电胶粘贴于载物台上，把样品粉末均匀分布于导电胶表面，采用真空镀膜法在4Pa以下高真空、电流20mA条件下喷镀铂金属2min使样品导电。仪器的加速电压为15.0kV，工作距离为10.3mm。用SEM在、倍下观察样品。
2.3FT-IR分析
取溴化钾于玛瑙研钵中，在红外烤灯下研磨成细粉；转移至压片模具中，将模具置于压片机中压实，得半透明薄片，即溴化钾空白片。取3份余甘子霜S1、S2、S3样品粉末（过六号筛）适量，与溴化钾在玛瑙研钵中研磨，压片制成样品片，先将溴化钾空白片置于红外光谱仪中，扫描，得空白背景片的一维红外光谱。再将样品片置于红外光谱仪中，扫描得到样品片的一维红外光谱。
2.4.UPLC-Q-TOF-MS主要色谱峰的分析及鉴定
2.4.1色谱条件ThermoScientificAccucoreC18色谱柱（mm×2.1mm，2.6μm），流动相0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脱（0～1min，2%B；1～2min，2%～5%B；2～4min，5%～7%B；4～6min，7%～24%B；6～10min，24%～42%B；10～12min，42%～54%B；12～15min，54%～76%B；15～18min，76%～%B），体积流量为0.2mL/min，柱温为30℃，进样量为5μL。质谱条件：采用加热电喷雾离子源（HESI），正、负离子模式检测，喷雾电压为3.0kV，离子源温度为℃，鞘气体积流量为35arb，辅助气体积流量为10arb，离子传输管温度为℃，离子扫描范围为m/z～[12]。
2.4.2供试品溶液的制备按“2.1”项收集余甘子药材表面白霜，精确称量0.1g白霜置于量瓶中，加甲醇定容至刻度，称定质量，超声30min使溶解，静置冷却至室温，加甲醇补足减失的质量，用0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
2.4.3对照品溶液的制备准确称取各对照品适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，配制含柠檬酸0.mg/mL、粘酸0.mg/mL、DL-(＋)苹果酸0.mg/mL、没食子酸0.mg/mL、柯里拉京0.mg/mL、鞣花酸0.mg/mL的混合对照溶液，置于4℃冰箱备用，进样前用0.22μm微孔滤膜滤过。
2.4.4数据分析使用Xcalibur3.0软件进行质谱数据处理，将二级碎片实测谱图与对照品、相关文献，及在线数据库[Mzloud网络数据库，中药成分数据库OTCML，MassBank，人类代谢组数据库（humanmetabolomedatabase，HMDB）进一步分析和鉴定。
2.5析霜余甘子与未析霜余甘子E-tongue分析
2.5.1供试品的制备取3个批次表面析霜余甘子与未析霜余甘子，各称量10g，分别用mL温水冲泡20s，将余甘子捞出，取滤液为供试品溶液。析霜余甘子溶液标号为S1～S3，未析霜余甘子溶液标号为S4～S6。
2.5.2正、负极清洗液及参比液的制备①正极清洗液：准确称量7.46g氯化钾，用mL蒸馏水搅拌溶解，然后准确加入mL无水乙醇溶液，边搅拌边加入准确称量的0.56g氢氧化钾，溶解完毕后，转移到0mL的量瓶，定容。②负极清洗液：准确量取mL无水乙醇，与mL蒸馏水震荡混合，然后加入8.3mL的浓盐酸，搅拌混合后转移到0mL的量瓶，定容。③参比溶液：最后精密称定2.g氯化钾和0.g酒石酸，用mL蒸馏水溶解，转移到0mL量瓶中，定容。
2.5.3E-tongue测试方法开始时正、负极分别放入正、负极清洗液中清洗90s，接着用参比液清洗2次，各s，传感器在参比液中平衡归零，达到平衡条件后，开始测试，测试时间30s；在2组参比液中分别短暂清洗3s，传感器插入新的参比液中测试余味30s，循环测试4次，去掉第1循环，取后3次平均数据作为测试结果，每次清洗、平衡和测试余味的液体均分布在不同样品杯中[13]。
2.5.4样品测定将每个样品液倒入电子舌测试专用塑料小杯中，每杯25mL，每个样品倒2杯，按“2.5.3”项方法测试，记录传感器涩味传感器（AE1）、鲜味传感器（AAE）、咸味传感器（CTO）、苦味传感器（COO）、酸味传感器（CAO）、甜味传感器（GL1）的响应值，收集3次平行测定数据，求得平均值。
2.6析霜与未析霜余甘子溶液pH测定及志愿者风味评价
2.6.1pH测定取3个批次表面析霜余甘子与未析霜余甘子，各称量10g，分别用mL温水冲泡20s，将余甘子捞出，取滤液为供试品溶液。通过pH计分别对每个样品测定溶液pH值3次取平均值，析霜余甘子溶液标号为S1～S3，未析霜余甘子溶液标号为S4～S6。
2.6.2志愿者的筛选和训练感官评定依据国家标准（GB/T38-）和ISO进行筛选志愿者条件如下：年龄22～28岁，无严重过敏、遗传病史、无胆囊炎、无不良嗜好、无近期病史。制备0.5、0.8、1.0mg/mL的鞣酸溶液，规定涩味分值为2、5、10；制备0.5、1.0、2.0mg/mL的柠檬酸溶液，规定酸味分值为2、5、10；制备0.1、0.2、0.3mg/mL的硫酸奎宁溶液，规定苦味分值为2、5、10。分别定义为轻微、明显、剧烈，告知并要求志愿者记住不同样品的3个质量浓度梯度所对应风味分值[14]。
2.6.3供试品的制备取3个批次表面析霜余甘子与未析霜余甘子，各称量10g，分别用mL温水冲泡20s,将余甘子捞出，取滤液为供试品溶液。析霜余甘子溶液标号为S1～S3，未析霜余甘子溶液标号为S4～S6。
2.6.4志愿者感官试验选择10名训练合格的志愿者进行志愿者感官试验，试验前应具备以下条件：味觉敏感，1d内不饮酒、不吸烟，2h内不饮食，可自由饮用水。在每次品尝之前，小组成员用纯净水漱口，以舌背表面和舌缘为主要感受部位，每份样品口含10s后吐出，分别记录每个样品5、20、40、60、80、、、s各个时间段在口腔中感知强度，然后对每个样本的每个属性的感知强度进行评分，每份样品评定结束后间隔10min再进行下一份样品的评定。对于每个样品，感官评估一式3份进行，最后将每个时间段的评分相加得到这个样品的感知强度，再将结果取平均值[15]。
2.7质谱成像分析
2.7.1样品制备将余甘子切成均匀薄片，并在?80℃冰箱中冷冻。取出后，覆盖并压缩载玻片，然后冷冻干燥，备用。
2.7.2质谱条件及数据处理负离子扫描，扫描范围为m/z～，空间分辨率为μm，喷雾电压为4.5kV；采样锥电压为40V；喷雾器（氮气压力）为0.5MPa；溶剂为甲基甲酸（0∶1），体积流量为2μL/min；喷雾器入射角为70°；收集器角度为10°；离子源温度为℃；采样电压为?40V。数据采集软件为MasslynxV4.2，数据处理软件为MasslynxHDIV1.5软件。
3结果
3.1SEM和EDS分析结果
3.1.1SEM形貌观察通过SEM在（×，×）下检查样品，结果如图2所示。能够观察到白霜的晶体结构是由多个不规则的小团簇晶体堆积而成（×），小团簇晶体的直径为2～3μm，在倍下药材表面白霜结构更加明显。
3.1.2EDS元素测定通过SEM在×放大倍数下获得图像，结合EDS对白霜进行表面元素分析，元素分析结果如表2所示，表面白霜主要由C、O、K元素组成，C元素相对含量36.87%，O元素相对含量55.54%，K元素相对含量为7.59%。
3.2FT-IR分析结果
3个批次的余甘子药材表面白霜的红外光谱相似（图3），在.27～.47、.53～.18、.98～.21、.85、.34、.64、.13、.50cm?1处检查到主要吸收峰度，其中.27～.47cm?1可能是-OH拉伸振动吸收峰，～cm?1为R-COOH振动吸收峰，～cm?1为C=O或C=C拉伸振动吸收峰，.85cm?1是C-C或C==C骨架振动吸收峰，.64cm?1可能是C-O伸振动吸收峰，.13cm?1可能是OH弯（面内）振动吸收峰，.50cm?1可能是NH2振动吸收峰。
3.3UPLC-Q-TOF-MS分析结果
从余甘子表面白霜中鉴定出12个化合物，详细信息如表3所示。由表3信息可知，余甘子表面白霜的化学组成主要是一些小分子的有机酸类。
3.3.1有机酸类化合物在白霜中主要发现3种有酸类成分，主要有粘酸、柠檬酸、DL-(＋)苹果酸，这些有机小分子酸类，主要来源于植物细胞呼吸代谢中间体及产物，以化合物1粘酸为例，tR＝0.52min，母离子子峰m/z.[M－H]?，二级离子碎片m/z.，m/z.，相对保留时间和m/z比通常与对照品粘酸一致，通过比较确定该化合物为粘酸。化合物6，tR＝0.58min，母离子峰m/z.[M－H]?，二级离子碎片m/z85.，m/z.，相对保留时间和m/z比通常与对照品柠檬酸一致，通过比较确定该化合物为柠檬酸。化合物7，tR＝0.58min，母离子峰m/z.[M－H]?，二级离子碎片m/z.，m/z71.，相对保留时间和m/z比与对照品DL-(＋)-苹果酸保持一致。
3.3.2鞣质类成分余甘子中含有大量的鞣质类化合物，分为可水解鞣质和缩合鞣质，可水解鞣质会进一步分解为没食子鞣质和鞣花鞣质，在余甘子药材表面白霜中鉴定出2个鞣质，化合物8，tR＝8.26min，母峰离子m/z.[M－H]?，二级碎片离子m/z.、.，结合数据库推断为二没食子酰葡萄糖。化合物9，tR＝14.6min，母峰离子m/z.[M－H]?，二级碎片离子m/z.，相对保留时间和m/z比与对照品柯里拉京一致。
3.3.3酚酸类化合物余甘子中酚酸类成分主要有没食子酸、没食子酸酯等，在余甘子药材表面白霜中鉴定出4个酚酸类成分。化合物3（没食子酸），tR＝0.56min，母峰离子m/z.[M＋H]+，二级碎片离子m/z.、81.，相对保留时间和m/z比与对照品没食子酸一致。化合物4（没食子酸甲酯），tR＝0.57min，母峰离子m/z.[M＋H]+，二级碎片离子.、.。化合物5（粘酸-2-O-没食子酸酯），tR＝0.55min，母离子峰m/z.[M－H]+，二级碎片离子m/z85.、.0，结合数据库推断为粘酸-2-O-没食子酸酯。化合物10（鞣花酸），tR＝15.8min，母峰离子m/z.[M－H]–，二级碎片离子m/z.，相对保留时间和m/z比与对照品鞣花酸一致。
3.4E-tongue分析结果
E-tongue通过传感器阵列模拟人类的味觉感知，从而提供接近人类感官的味觉结果[10]。利用α-Astree感知系统分析对析霜及未析霜样品的口感进行评价，测定结果见表4，通过E-tongue系统分析可以发现析霜样品的酸味变化最大，明显增强，涩味和苦味也稍有增强，而余味及丰富度、咸味没有明显变化（图4）。E-tongue分析说明余甘子析霜对余甘子风味影响变化明显，主要影响在余甘子酸味及涩味。
3.5pH测定及志愿者风味评价结
3.5.1pH测定结果分别测定了析霜余甘子药材与未析霜余甘子药材的滤液pH值，表面析霜的余甘子药材滤液pH值低于未析霜药材的pH值。表面析霜的余甘子药材滤液pH值主要集中在3.62～3.96，未析霜的余甘子药材滤液pH值主要集中在6.31～6.48（图4），即析霜余甘子药材的滤液酸性更强。
3.5.2志愿者口尝实验结果将口尝试验结果进行处理，先对志愿者评分做Spearman系数检验，将实验结果中达到剔除水平的数据进行循环剔除。按照“2.6.4”项的方法对余甘子风味评分进行统计，统计结果见表5。利用Hiplot软件对志愿者评分进行热图分析。红、黑、绿代表高、中、低3个丰度，丰度越高代表感官感知能力越强。同一批次的余甘子药材，析霜者酸味明显高于未析霜者，涩味也是类似规律，析霜后苦味也略有增强，而生津作用在析霜后也明显增强（图4）。采用SIMCA-P软件（version14.0，Umea，瑞典）对供试品进行主成分分析，选择集中法（Ctr）作为标度法，结果表明，主成分分析（principal